文献信息
研究背景
- 立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）是一种全球性的病害，能够侵染危害多种作物，如水稻、小麦、玉米、马铃薯、大豆、番茄及白菜等。
- 防治主要依靠化学杀菌剂，农事操作和生防控制的效果一般般。
- 立枯丝核菌4个代表性的融合群都有基因组草图。比较基因组和转录组发现不同融合群之间的遗传结构和基因表达具有差异。水稻受立枯丝核菌侵染后糖酵解和氧化戊糖磷酸途径发生显著变化。最近的一些研究利用GWAS找到与水稻/玉米纹枯病相关的基因。
- 多核的立枯丝核菌可以分为14个“亚群”，报错AG-1到AG-13和AGB1. 其中AG4-HGI 3是从荞麦中分离得到的，能够导致荞麦茎秆溃烂、湿病和幼苗死亡，造成严重的产量损失。但是荞麦抗该菌的遗传机制还不清楚。
研究结果
组装AG4-HGI 3基因组发现大量致病相关基因
首先接种试验发现这个菌不仅能够侵染单子叶植物，还能侵染双子叶植物。
通过比较基因组发现这个菌在分类上属于AG4这个“亚群”，而且发现了大量基因存在扩张和丢失现象。在这些扩张的基因中，大量基因和植物细胞壁相关，如果胶、纤维素、半纤维素、木质素等。病原菌致病基因通常会编码碳水化合物活性酶（CAZymes），研究者就想关注这些基因的变化情况。发现大约有5.45%的编码基因，也就是1026个基因参与这些关键的过程。【AA，辅助活性；CE，碳水化合物酯酶；GT，糖基转移酶；GH，糖苷水解酶水解酶；CBM，碳水化合物碳水化合物结合模块；PL，多糖裂解酶。】
此外，研究者还预测了 2,355 个毒力基因、3,099 个病原-宿主相互作用基因、2,124 个转运体基因、2,071 个跨膜蛋白基因和 19 个次级代谢产物生物合成基因。
AG4-HGI 3侵染过程中大量病原西瓜基因表达上调
下一步，就是利用转录组技术探究AG4-HGI 3侵染荞麦过程中基因表达变化情况。设置了3个时间点：6小时、14小时和22小时。发现在这三个不同的时期，这个菌均有大量的基因表达上调，侵染后6小时只有503个基因表达上调，但是14小时就就有2102个基因表达上调，14小时到22小时变化不大。这说明这个菌在侵染荞麦后的14小时左右有大量基因表达上调。进一步分析这些表达上调的基因发现大量基因与致病相关。KEGG注释发现这些差异基因大多和核糖体相关，表明这个菌在侵染荞麦过程中发生的转录翻译具有代谢活性。
进一步的，还是和基因组分析类似，将CAZymes相关的基因挑选出来查看其表达情况。和基因组结果类似，这个菌在侵染荞麦的过程中与CAZymes相关的大量基因表达上调。这个结果也为进一步探究这个菌的侵染机制奠定了基础。
除了CAZymes相关的基因外，研究者还选择已经报道过的4个致病基因的同源基因进行异源表达。结果发现和对照相比，这4个毒性基因菌能够显著提高寄主的感病性。也就意味着这些毒性基因在这个菌侵染苦荞的过程中发挥中重要功能。
JA途径参与苦荞对AG4-HGI 3的响应
在探究了AG4-HGI 3在侵染过程中的基因变化情况，研究者进一步的想探究寄主—苦荞在响应这个病原菌侵染过程中的转录表达变化。和病原菌的差异基因数量变化情况一致，随着侵染时间的变化，越来越多的基因参与到这个过程中。KEGG富集分析发现这些差异基因主要和植物次级代谢和植物激素信号转到相关。
既然是植物激素在其中发挥功能，那么到底是哪个激素在发挥功能呢？研究者使用共培养（侵染）的方法发现是JA在发挥作用。
在确定是JA在发挥功能后，研究者从转录组数据中将JA相关的基因筛选出来观察其表达量，发现这些基因的确实是发生了变化。进一步的，为了进一步确认这个结果，研究者直接用MeJA处理荞麦，然后进行转录组测序，将两次转录组的数据进行整合分析发现大量共有基因发生了差异表达变化。在此基础上，利用KEGG发现这些共有的基因大多与本丙烷和类黄酮合成相关。前期有研究发现JA能够调控类黄酮的是生物合成，而类黄酮则参与植物对生物胁迫的响应。研究者就假设这个病原菌侵染过程中，荞麦植株体内JA发生变化，从而调控类黄酮的生物合成，进而影响植株对这个病原菌的抗性。
证明了是JA在发挥作用，也把JA相关的同源基因都找出来了，那有没有新的基因呢？还真发现一个！而且通过qPCR和异源表达都发现了这个基因确实能够提高荞麦植株对立枯丝核菌的抗性。而且，过表达这个基因后，类黄酮的含量都显著的升高了。
利用基于转录组的GWAS挖掘荞麦更多的抗性基因
上面这一些列的操作确实是找到了关键的基因。但是，荞麦抵抗立枯丝核菌过程中发挥功能的基因肯定不止这一个，那怎么样才能把这些基因都挖掘出来呢？GWAS！
研究者从全世界收集了320个荞麦种质资源并接种立枯丝核菌，病情指数变异系数大概是65.6%，这表明这个群体对立枯丝核菌的抗性差异很大。用病情指数作为表型，一共鉴定到122个显著相关的SNP位点，这些SNP分布在7条染色体上。在这些SNP上下游200kb的范围内寻找潜在的关键基因，一共发现790个候选基因。对这些候选基因进行KEGG注释分析发现有14个基因与植物-病原互作相关，这说明GWAS结果是比较准确的。
在这个基础上，考虑到次级代谢在植物抗病过程中是非常重要的，研究者便将GWAS的结果与之前的mGWAS进行比较，发现有5个区域是重叠是，这5个区域与抗病代谢物和病情指数相关。
在这个基础上，研究者将转录组和GWAS的结果进行整合分析。发现转录组中发生显著变化的基因中有106个位于GWAS结果中的15个基因组区域。这106个基因中有49个基因在立枯丝核菌侵染后或MeJA处理后表达上调。这些基因的同源基因在先前的研究中被发现与植物抗性相关。
FtASP受JA诱导后能够通过抑制菌丝的生长阻止AG4-HGI 3的侵染
为了进一步探究荞麦对AG4-HGI 3的抗性并验证GWAS结果的准确信，研究者从GWAS结果中筛选6个基因进行验证。异源表达发现这些基因都可以提高荞麦对立枯丝核菌的抗性。在这6个基因中，FtPinG0302743900编码天冬氨酸蛋白酶（FtASP），而且能够和毒性蛋白RsYTHDC互作。这个基因在320个材料中具有三种单倍型，而且C单倍型的抗性更高。qPCR检测基因表达发现这个基因表达量越高的品种对立枯丝核菌的抗性越强。过表达这个基因后，荞麦对立枯丝核菌的抗性显著提高。
